رنگ آمیزی گرم

عنوان آزمایش:رنگ آمیزی گرم                                                                                                                                                                          هدف آزمایش: تعیین باکتری های گرم منفی وگرم مثبت                                                                                                                                     مقدمه : اشریشیا کُلی که بطور اختصار E.coli نیز نامیده می‌شود، نوعی باسیل گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه‌است که بطور شایع در روده جانوران خونگرم وجود دارد. بیشتر سویه‌های اشریشیا کلی، بی‌آزار هستند اما برخی از سروتیپ‌ها موجب مسمویت غذایی و اسهال می‌شوند.[۱] این سویه‌های بی‌آزار، بخشی از فلور عادی روده هستند. آن‌ها در تولید ویتامین K2 نقش دارند و از استقرار باکتری‌های بیماریزا در روده جلوگیری می‌کنند. این باکتری، ۰/۱% فلور روده را به خود اختصاص داده‌است. این باکتری از طریق مسیر مدفوعی-دهانی (به انگلیسی: oral- fecal)‏ از یک فرد به فرد دیگر منتقل می‌شود.                                                                                                                         +++رنگ آمیزی گرم : GRAM STAIN

این روش رنگ آمیزی یکی از مهمترین ومتداولترین روشهای رنگ آمیزی درباکتری شناسی است که اولین بار توسط کریسین گرم ابداع شد . دراین رنگ آمیزی باکتریها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت وگرم منفی تقسیم می شوند . رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد . دررنگ آمیزی گرم باکتریهای گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می شود

شرح آزمایش :1- رنگ کریستال ویوله رابه مدت 30تا45 ثانیه برروی گسترش ریخته درنتیجه همه باکتری ها بهرنگ بنفش درخواهد درآمد

2- پس از شستشو گسترش با آب به مدت 30تا45 ثانیه بالوگل می پوشانند لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس های بزرگی می نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می شود . پس ازاین مرحله نیزکماکان همه باکتریها به رنگ بنفش مشاهده می شوند .

مرحله رنگ زدایی مهمترین مرحله رنگ آمیزی است دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت 15 تا20 ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد  . درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد . ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت تعداد زیاد لایه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .

4- در انتها سطح گسترش راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت 30 تا45 ثانیه می پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد . دراین مرحله باکتریهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آیند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند .

                         رنگ آمیزی گرم

یک نوع رنگ آمیزی افتراقی است که اولین بار توسط کریستین گرم کشف شد. این روش مفید ترین روش برای تشخیص و درمان میکروب ها به شمار می آید. بر این اساس، باکتری ها را به دو دسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می کنند.

روش کار

الف) تهیه گسترش

ب) خشک کردن

ج) فیکس کردن

د) رنگ آمیزی: در این مرحله رنگ کریستال ویوله را به مدت یک دقیقه روی نمونه می ریزیم و بعد شست و شو می دهیم. در این مرحله همۀ باکتری ها به رنگ بنفش در می آیند.

ﮬ) استفاده ار لوگل: لوگل را به مدت یک دقیقه روی نمونه می ریزیم و بعد شست و شو می دهیم. این محلول نقش تثبیت رنگ کریستال ویوله  را دارد و در دیواره باکتری تشکیل کمپلکس کریستال ویوله-ید (CVI) را می دهد.

و) استفاده از الکل استن یا اتیل الکل: این محلول رنگ بر است. این محلول را به مدت 10 تا 20 ثانیه روی نمونه می ریزیم و بعد شست و شو می دهیم. این محلول دو نقش مهم دارد. اول اینکه حلال چربی هست و دوم اینکه دهیدرات کنندۀ پروتئین هاست.

دیوارۀ باکتری های گرم مثبت تشکیل شده از پپتیدوگلیکان و مقدار کمی لیپید است. وقتی که محلول رنگ بر استفاده می کنیم، چربی ها را در داخل خودش حل می کند و یک سری منافذ در دیواره ایجاد می کند. چون گرم مثبت ها چربی کمی در دیواره شان دارند، منافذ کمی در دیواره شان ایجاد می شود که این منافذ با عمل دهیدراته کردن پروتئین ها بسته می شوند. در نتیجه کمپلکس کریستال ویوله-ید حفظ می شود و رنگ باکتری بنفش می ماند. اما باکتری های گرم منفی چون در دیواره شان چربی زیادی دارند، در اثر استفده از الکل منافذ زیادی در دیواره شان ایجاد می شود که این منافذ با دهیدراته کردن پروتئین ها بسته نمی شوند و باکتری طی عمل رنگ بری بی رنگ می شود

ر) استفاده ار سافرانین یا فوشین: این محلول را به مدت یک دقیقه روی نمونه می ریزیم و بعد شست و شو می دهیم. در طی این مرحله باکتری هایی که بی رنگ شده اند به رنگ صورتی تا قرمز در می آیند. یعنی در واقع اختلاف باکتری های گرم مثبت و گرم منفی به تراوایی بیشتر باکتری های گرم منفی به الکل است.

واژه CLAS  برای رنگ آمیزی گرم به  رمز این روش معروف میباشد

C رنگ کریستال ویوله

L لوگول

A استون الکل

S سافرانین